Saat ini, terdapat banyak metode penelitian non-klinis in vitro dan in vivo, serta pengalaman dari pengembangan obat-obatan yang dipasarkan. Namun, memprediksi efikasi dan keamanan klinis melalui studi non-klinis yang dioptimalkan masih menjadi tantangan, dan artikel ini melakukan analisis mendalam tentang masalah ini.
ADC yang ideal harus memiliki setidaknya tiga karakteristik berikut:
1. Kemampuan pengikatan penargetan: Antigen target ADC yang ideal hanya diekspresikan pada permukaan tumor dan pada tingkat tinggi, tanpa mudah dilepaskan.
2. Proses transformasi: Sebelum mencapai sel target, molekul sitotoksik idealnya tidak terlepas dari ADC, artinya seluruh ADC diinternalisasi ke dalam sel.
3. Pelepasan molekul kecil toksin: Molekul kecil harus dilepaskan dengan cepat dan massal dalam sel tumor; molekul kecil harus memiliki toksisitas tinggi untuk membunuh sel tumor secara efisien.
Strategi Evaluasi Farmakologi untuk ADC
Penelitian tindakan farmakologis biasanya dilakukan selama fase penemuan obat atau evaluasi praklinis. Proyek eksperimental utama yang perlu dilakukan meliputi aktivitas pengikatan target, internalisasi yang dimediasi antibodi, penghambatan proliferasi tumor in vivo dan in vitro (untuk ADC anti-tumor), sitotoksisitas seluler yang bergantung pada antibodi (ADCC), dan sitotoksisitas yang bergantung pada komplemen (CDC).
Ketika meneliti farmakodinamik ADC pada hewan, pertimbangan pertama adalah perbedaan spesies. Jika ADC tidak memiliki aktivitas pengikatan atau memiliki aktivitas pengikatan rendah dengan antigen pada tikus, perlu dipertimbangkan penggunaan hewan transgenik untuk eksperimen farmakodinamik, atau melakukan studi farmakodinamik in vivo dengan antibodi yang berasal dari hewan. Hewan transgenik dapat menghindari penggunaan antibodi alternatif, dan ketika antigen target diekspresikan dalam pembuluh darah atau stroma inang, hewan transgenik tidak hanya dapat mengevaluasi efek farmakodinamik tetapi juga mengamati reaksi toksisitas sampai batas tertentu. Jika antigen target hanya diekspresikan dalam sel tumor manusia, tidak diperlukan hewan transgenik; efek farmakodinamik dapat diperiksa pada model tikus telanjang yang ditanamkan dengan sel tumor manusia. Ketika melakukan studi farmakodinamik pada tingkat sel atau tingkat model hewan, melakukan studi PK/PD secara bersamaan, menganalisis distribusi penargetan obat, tingkat hunian reseptor, dan hubungan antara paparan dan efek obat dapat membantu dalam perancangan rejimen dosis klinis dan analisis hasil studi keamanan.
Strategi Evaluasi Toksikologi untuk ADC
Pemilihan spesies hewan: Untuk mengungkap sepenuhnya karakteristik toksisitas ADC dalam studi keamanan nonklinis guna mendukung pengembangan klinis ADC, penilaian relevansi spesies hewan uji dan kemampuan menerjemahkan hasil studi nonklinis sangatlah penting. Penentuan ini biasanya melibatkan pemeriksaan afinitas pengikatan ADC terhadap antigen target pada spesies nonklinis dibandingkan dengan manusia, serta membandingkan spektrum pewarnaan imunohistokimia dalam studi reaktivitas silang jaringan. Fungsi efektor atau imunogenisitas antibodi juga dapat bervariasi karena perbedaan spesies.
Parameter paparan dan metabolisme: Selain itu, seperti obat dan produk biologis lainnya, ekstrapolasi hasil studi non-klinis ke manusia harus mencakup perbandingan parameter paparan dan metabolisme. Misalnya, BR-96 adalah ADC yang dibentuk dengan menghubungkan doksorubisin (DOX) secara kovalen ke residu sistein dari antibodi monoklonal BR96 yang dihumanisasi melalui penghubung hidrazida asam maleimidoheksanoat 6-. Studi toksikologi telah menunjukkan bahwa, tidak seperti pada tikus dan monyet, anjing lebih sensitif terhadap efek toksik BR-96, dengan enteritis hemoragik sebagai toksisitas pembatas dosis. Anehnya, BR96-DOX dan antibodi monoklonal BR96 yang tidak dimodifikasi memiliki toksisitas pembatas dosis yang sama, yang menunjukkan bahwa toksisitas tersebut dihasilkan oleh antibodi monoklonal. Tidak seperti DOX yang tidak dimodifikasi, ADC tidak menyebabkan kardiomiopati pada model tikus. Oleh karena itu, pemilihan dosis untuk uji klinis Fase I BR96-Dox pada subjek manusia didasarkan pada hasil toksikologi pada anjing.
Ekspresi target antibodi: Seperti antibodi monoklonal terapeutik, evaluasi nonklinis ADC dapat terhambat oleh kurangnya target antigen pada spesies hewan uji. Pedoman ICH S6 (R1) tentang evaluasi keamanan praklinis obat-obatan yang berasal dari bioteknologi (2011) menyatakan, "Pemilihan spesies untuk konjugat antibodi-obat/toksin (ADC) yang mengandung toksin/racun baru harus mengikuti prinsip umum yang sama seperti untuk antibodi yang tidak dimodifikasi. Spesies hewan yang relevan untuk pengujian antibodi monoklonal adalah spesies yang mengekspresikan epitop yang diperlukan dan menampilkan spektrum reaktivitas silang jaringan yang mirip dengan jaringan manusia. Oleh karena itu, spesifisitas spesies dan penyakit dapat menentukan atau membatasi evaluasi nonklinis."
Ekspresi jaringan normal dari antigen target merupakan masalah keamanan utama untuk terapi ADC. Idealnya, antigen target harus diekspresikan pada tingkat yang sangat rendah pada sel normal; namun, seperti yang disebutkan dalam dua contoh di atas, antibodi tidak selalu spesifik dalam praktik. Contoh toksisitas potensial lainnya yang terkait dengan kurangnya spesifisitas untuk target ADC meliputi NaPi2b, transporter fosfat yang bergantung pada natrium, yang diekspresikan dalam beberapa jenis tumor tetapi juga dapat dideteksi dalam jaringan normal, yang berperan dalam homeostasis fosfat anorganik. ADC (anti-NaPi2b-vc-MMAE) dikembangkan dengan menggabungkan antibodi monoklonal IgG1 anti-NaPi2b humanisasi ke MMAE melalui penghubung peptida vc, dan dipastikan memiliki afinitas pengikatan spesifik dalam jaringan manusia normal dan monyet kepiting. Namun, meskipun ekspresi tingkat tinggi di paru-paru monyet normal, keamanan reaktivitas silang ini dapat diterima, dengan toksisitas yang membatasi dosis yang tidak terkait dengan ekspresi jaringan normal. Efek toksikologi pada tikus normal, spesies yang tidak mengikat, dan monyet konsisten dengan farmakologi MMAE.
Prinsip desain toksikologi umum: Secara umum, tidak perlu menetapkan kelompok terpisah untuk antibodi monoklonal/antibodi murni, linker/toksin linker, karena molekul antibodi monoklonal merupakan salah satu faktor utama yang memengaruhi atau menentukan paparan sistemik. Desain dosis harus mempertimbangkan dosis farmakodinamik ADC, karakteristik molekul antibodi, dan fitur toksisitas toksin molekul kecil.
Fokus pada toksisitas terkait muatan:Meskipun pelepasan senyawa molekul kecil yang ditargetkan mencapai pengayaan obat dalam jaringan target, meningkatkan jendela terapeutik, karakteristik toksisitas utama ADC masih mirip dengan senyawa molekul kecil yang terhubung. Sebagian besar reaksi toksisitas ADC kurang parah daripada pemberian langsung senyawa molekul kecil, tetapi beberapa ADC dapat meningkatkan reaksi toksisitas jaringan yang terkait dengan pengikatan target antibodi atau pengikatan di luar target. Meskipun ADC meningkatkan pelepasan senyawa molekul kecil yang ditargetkan, beberapa senyawa molekul kecil masih dilepaskan sebelum waktunya, dan beberapa senyawa molekul kecil bebas dapat dengan cepat berdifusi atau berpindah ke jaringan sekitar dan sirkulasi sistemik dari sel target, atau apoptosis dan kerusakan sel target dapat menyebabkan senyawa molekul kecil bebas memasuki sirkulasi sistemik. Bagian antibodi dari ADC juga dapat mengikat reseptor permukaan sel organ jaringan non-target atau epitop lainnya, seperti fagositosis seluler yang dimediasi reseptor Fc, dan obat tersebut dapat memberikan efek toksik pada sel jaringan yang sesuai setelah kerusakan metabolik. Oleh karena itu, toksisitas ADC berkaitan erat dengan karakteristik antibodi, senyawa molekul kecil, dan penghubung, dan perubahan karakteristik toksisitas ADC akan terjadi seiring dengan variasi antibodi, senyawa molekul kecil, dan penghubung. Dalam studi keamanan non-klinis, perhatian harus diberikan pada dampak struktur komposisi obat dan karakteristik farmakokinetik pada toksisitas, dan hasil percobaan harus dianalisis secara komprehensif.
Genotoksisitas:Makromolekul biologis umumnya tidak berinteraksi langsung dengan DNA, dan ADC beserta bagian antibodinya biasanya tidak perlu menjalani uji genotoksisitas. Potensi genotoksisitas ADC berasal dari senyawa molekul kecil. Jika senyawa molekul kecil muatan merupakan senyawa baru, uji genotoksisitas harus dilakukan; untuk senyawa molekul kecil bebas baru dan/atau penghubung baru yang diproduksi dalam tubuh, bahan uji target harus dievaluasi berdasarkan sifat fisikokimia, karakteristik pembelahan, dan struktur produk pembelahan ADC; jika data yang cukup menunjukkan bahwa bahan uji target memiliki genotoksisitas, tidak diperlukan studi genotoksisitas.
Toksisitas reproduksi:Senyawa molekul kecil, penghubung, dan antibodi telanjang dalam ADC dapat memiliki efek buruk pada organ reproduksi, kesuburan, perkembangan embrio-janin, dan perkembangan keturunan, sehingga risiko toksisitas reproduksi ADC harus diperhatikan. Strategi penelitian, desain eksperimen, implementasi, dan evaluasi toksisitas reproduksi ADC harus mengacu pada pedoman ICH S5, dan menggabungkan mekanisme kerja dan populasi target ADC untuk mengadopsi strategi analisis spesifik masalah. ADC yang ditujukan untuk pasien tumor stadium lanjut dapat mengacu pada pedoman ICH S9 untuk penelitian toksisitas reproduksi.
Untuk produk biologis, toksisitas reproduksi biasanya dievaluasi pada spesies hewan yang relevan secara farmakologis. Jika hewan pengerat dan kelinci merupakan spesies hewan terkait pengikatan target, dua spesies hewan harus digunakan untuk melakukan uji toksisitas perkembangan embrio-janin, kecuali jika kematian embrio atau teratogenisitas telah dikonfirmasi pada satu spesies. Jika spesies hewan pengikatan target adalah primata non-manusia atau tidak ada spesies hewan yang relevan, tikus atau kelinci biasanya dipertimbangkan terlebih dahulu untuk uji toksisitas reproduksi guna menyelidiki toksisitas reproduksi senyawa molekul kecil bebas. Jika hasil studi mengonfirmasi kepositifan, tidak perlu menyelidiki toksisitas reproduksi menggunakan spesies hewan terkait pengikatan target; jika tidak, primata non-manusia atau hewan transgenik atau molekul alternatif harus dipertimbangkan untuk pengujian guna mengidentifikasi toksisitas reproduksi yang dimediasi antigen. Jika antibodi atau senyawa molekul kecil dalam ADC memiliki data literatur yang secara jelas menunjukkan potensi risiko toksisitas reproduksi, studi toksisitas reproduksi tidak diperlukan dan pengendalian risiko yang relevan dapat didasarkan pada informasi literatur.
Karsinogenisitas:Berdasarkan karakteristik ADC, perlunya studi karsinogenisitas dapat dipertimbangkan menurut ICH S1, ICH S6, ICH S9, dan pedoman terkait lainnya.
Imunogenisitas/Imunotoksisitas:ADC dapat menyebabkan imunogenisitas setelah memasuki tubuh, menghasilkan antibodi anti-obat. Evaluasi imunogenisitas ADC membantu menganalisis hasil farmakokinetik, efikasi, dan keamanan obat, sehingga deteksi antibodi anti-obat biasanya disertai dalam studi keamanan non-klinis ADC. Antibodi anti-obat dapat diproduksi dari bagian antibodi dan bagian penghubung ADC, dan apakah pemeriksaan lebih lanjut terhadap epitop antigen diperlukan harus didasarkan pada risiko imunogenisitas. Pengembangan, validasi, dan strategi deteksi analitis untuk analisis imunogenisitas ADC harus mengikuti "Pedoman Teknis untuk Penelitian Imunogenisitas Obat". ADC dapat merujuk ke ICH S6, ICH S8, ICH S9, dan pedoman lainnya, dan secara wajar merancang indikator deteksi imunotoksisitas berdasarkan faktor-faktor seperti jenis dan mekanisme kerja ADC. Selain studi imunotoksisitas rutin, studi imunotoksisitas tambahan harus dipertimbangkan jika diperlukan.
Keamanan optik:Sebelum uji klinis Fase I, potensi fototoksisitas harus dievaluasi terlebih dahulu berdasarkan sifat fotokimia dan kategori farmakologis/kimia dari senyawa molekul kecil (termasuk penghubung). Jika data ini menunjukkan potensi risiko, tindakan perlindungan yang tepat harus diambil untuk subjek uji klinis. Jika data non-klinis atau pengalaman klinis tidak dapat sepenuhnya mengevaluasi risiko keamanan foto, penilaian keamanan foto yang sejalan dengan prinsip-prinsip yang dijelaskan dalam ICH S10 harus diberikan sebelum uji klinis sampel besar (Fase III).
Reaksi silang jaringan:Studi reaktivitas silang jaringan adalah uji pengikatan jaringan in vitro yang dilakukan menggunakan teknik imunohistokimia untuk menentukan karakteristik pengikatan antibodi dan epitop antigen dalam jaringan. Studi reaktivitas silang jaringan dapat memberikan informasi tambahan yang berguna untuk memahami distribusi target dan juga dapat memberikan informasi tentang potensi pengikatan yang tidak diharapkan. Studi reaktivitas silang jaringan menggunakan jaringan manusia merupakan bagian integral dari rangkaian evaluasi keamanan dosis klinis awal untuk obat antibodi. Ketika tidak ada spesies hewan yang terkait dengan pengikatan target, informasi reaktivitas silang jaringan sangat penting untuk memprediksi risiko toksisitas pada manusia. Untuk ADC yang ditujukan untuk indikasi tumor stadium lanjut, studi reaktivitas silang jaringan tidak diperlukan jika tidak ada masalah khusus setelah mengevaluasi efek toksikologi pada spesies hewan yang relevan.
Saat ini, ICH, FDA, NMPA, dan lembaga lainnya telah mengeluarkan pedoman teknis yang relevan untuk penelitian farmakologi dan toksikologi non-klinis ADC. Peneliti dapat merancang studi farmakologi dan toksikologi non-klinis yang masuk akal secara ilmiah berdasarkan karakteristik obat, memaksimalkan ekstrapolasi efek farmakodinamik tingkat hewan non-klinis dan reaksi toksisitas pada manusia, memprediksi kemanjuran dan keamanan ADC dalam aplikasi klinis, sehingga meningkatkan tingkat keberhasilan uji klinis dan mengurangi risiko pengembangan. Pengembang obat dapat berkomunikasi dengan lembaga regulasi berdasarkan hasil penelitian awal dan masalah yang ada untuk mendapatkan informasi dukungan penelitian non-klinis yang terstandarisasi secara ilmiah.
